CRISPR/Cas9技術(shù)作為第三代基因組編輯技術(shù)，憑借其操作簡單、價格低廉和編輯效率高等優(yōu)點已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于生物工程、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)和環(huán)境等領(lǐng)域的研究，并且參與推動藥物開發(fā)、免疫治療和基因治療領(lǐng)域的突破。和TALEN和ZFNS技術(shù)一樣，CRISPR/Cas9技術(shù)在應(yīng)用時也存在一定概率的脫靶問題——Cas9核酸酶在非目標位點發(fā)生切割，引入非預(yù)期的基因突變。脫靶切割引入的突變可能會直接破壞細胞的基本功能，帶來不可預(yù)控的嚴重后果。因此，為了提高CRISPR技術(shù)在臨床研究上的安全性，通過高靈敏度的全基因組脫靶效應(yīng)檢測優(yōu)選脫靶效應(yīng)低的實驗方案是推進基因編輯技術(shù)走向臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。
安必奇生物建立了成熟的基因組編輯、高通量測序和生物信息學(xué)分析平臺，為客戶提供全面的CRISPR/Cas9脫靶效應(yīng)檢測和分析服務(wù)。我們的檢測方法包括全基因組測序、GUIDE-Seq和CIRCLE-Seq。
表1.常用的脫靶檢測方法
| 檢測方法 | 方法原理 | 特點 |
| 脫靶預(yù)測結(jié)合PCR檢測法 | 利用脫靶預(yù)測軟件預(yù)測潛在的脫靶位點，PCR擴增預(yù)測的脫靶位點，利用直接測序或酶切法檢測脫靶情況。 |
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| 全基因組測序 | 一種通過高通量測序檢測脫靶突變的方法，需要選擇適當(dāng)?shù)膮⒖蓟蚪M過濾背景突變，數(shù)據(jù)比對分析獲得含有PAM基序的潛在修飾位點，進一步基因擴增驗證其突變情況。 |
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| BLESS | 利用生物素標簽對DSBs進行原位標記，后經(jīng)PCR擴增實現(xiàn)對于生物素標記片段的富集，并通過二代測序?qū)崿F(xiàn)脫靶位點檢測。 |
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| LAM-HTGTS | 片段化的gDNA經(jīng)過LAM-PCR引入接頭，然后進行全基因組易位測序。 |
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| GUIDE-Seq | 將dsODNs標簽整合到DSBs位點，通過二代測序檢測這些標簽所在的基因組區(qū)域，從而確定脫靶突變的位置。 |
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| Digenome-Seq | 片段化的gDNA與CRISPR/RNP混合孵育，進行全基因組測序檢測脫靶。 |
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| CIRCLE-Seq | 將gDNA打斷并環(huán)化，環(huán)化的DNA與CRISPR/RNP孵育，NGS測序檢測線性化的DNA片段，確定脫靶位點。 |
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安必奇生物提供sgRNA脫靶效應(yīng)評估服務(wù)，幫助您挑選高度特異，脫靶率低的sgRNA進行后續(xù)實驗。同時，我們也協(xié)助您檢測分析基因編輯后細胞樣品的脫靶情況，通過各種高通量測序檢測技術(shù)，我們能準確的分析全基因組范圍內(nèi)的脫靶位點，推動CRISPR/Cas9技術(shù)在治療藥物開發(fā)和臨床研究中的應(yīng)用。
我們的優(yōu)勢
靈敏度高：能檢測低頻脫靶突變
準確性高：檢測結(jié)果可通過實驗驗證
多種檢測方法可選擇以滿足不同的實驗需求
參考文獻：
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Kim D, et al. (2015) 'Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells', Nature Methods, 12(3): 237-43.
Tsai SQ, et al. (2017) 'CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets', Nature Methods, 14(6).